同仁眼科专家聚合酶链反应联合直接基因测
摘要
目的探讨利用聚合酶链反应(PCR)联合直接基因测序技术检测感染性眼内炎的可行性及有效性，为感染性眼内炎患者的快速诊断寻求一种新的检测方式。方法对我院年10月至年10月手术治疗的感染性眼内炎患者47例47眼，手术取材进行PCR联合直接基因测序检查并与细菌涂片、细菌培养、真菌培养、厌氧菌培养检查结果对比。结果PCR联合基因诊断方法检查时间较传统方法耗时少。PCR病原菌检测阳性率高，为25例，25例阳性者中经直接基因测序出病原体类型19例。与病原体培养相比，敏感性为91.67%，特异性为77.14%，Kappa值为0.。结论对于感染性眼内炎，PCR联合直接基因测序技术是一种快速﹑有效的临床检查技术。
关键词：眼内炎、感染性、聚合酶链反应、基因测序
感染性眼内炎是眼科最严重的疾病之一，及时、有效的抗生素治疗是控制感染性眼内炎的重要手段。而选择病原学检查方法、快速明确病原体对选择敏感治疗药物非常重要。年10月至年10月我院手术治疗的感染性眼内炎患者共47例47眼，手术取房水或玻璃体标本尝试通过聚合酶链反应(PCR)联合直接基因测序技术对标本进行检测，报告如下。
对象与方法
一、一般资料
本组47例(47眼)，男37例，女10例;年龄11～79岁，平均33岁;均伴有前房或玻璃体化脓性炎症改变。其中眼球穿通伤34例，内眼手术后11例，内源性2例。临床表现前房积脓34例，外伤性白内障29例，人工晶体眼8例，眼内异物6例，视网膜脱离21例，手术前高眼压5例，手术前低眼压19例。
二、方法
1.手术取材：患者确诊感染性眼内炎后即刻手术，同时取材。手术采取前房穿刺或玻璃体切割术，前房穿刺术中抽取房水0.1～0.2ml;玻璃体切割术中取玻璃体，玻璃体尽可能取5ml以上。
2.实验室检查：将取材标本分为两组，分别做PCR联合基因诊断(研究组)和传统病原学检查(对照组)。PCR联合基因诊断：①DNA提取，取标本离心，裂解后，-20℃保存。②PCR反应，PCR扩增选择16SrRNA通用引物，上游引物BSF(8/20)：5’-AGAGTTTGATCCTGGTCTAG-3’;下游引物BSR(/18)：5’-ATTACCGCGGCTGCTGCTGGC-3’。目的片段bp左右。电泳后应用凝胶成像分析仪观察结果。③采用同样条件的眼内灌注液作为阴性对照。④实验的灵敏度：革兰阴性菌选择普通大肠杆菌，革兰阳性菌选择金黄色葡萄球菌作为参考菌株，双蒸水为阴性对照，来计算16SrRNA基因PCR扩增检测实验灵敏度均为cfu/ml。⑤DNA测序及序列分析：PCR产物采用回收试剂盒回收，选用测序试剂盒反应，进一步由测序仪测序分析。获得序列后，登陆国际生物技术信息中心(NCBI)的GenBank数据库进行BLAST比对，分析序列。传统病原学检查：取材标本分别做涂片检查和病原菌培养及药物敏感试验。涂片检查主要行革兰染色和真菌检查。病原菌培养分别做细菌、真菌和厌氧菌培养。
3.仪器及试剂：台式离心机(SIGMA3-18K)，聚合酶链反应(PCR)测定仪，电泳仪(北京市六一仪器厂，DYY-2C型)，凝胶成像分析仪(YANONGIS)，基因序列测序仪(CEQ，美国)。DNA提取试剂盒(博奥晶芯通用型细菌DNA快速提取试剂盒)，Taq酶试剂盒(大连宝生物)，琼脂糖凝胶回收试剂盒(OMEGA公司)，测序反应试剂盒(BECKMAN公司)。
三、统计学方法
应用SPSS13.0统计软件，计数资料的比较采用x检验。
结果
一、检出时间
研究组PCR联合基因诊断方法需8h;对照组细菌培养需96h，真菌培养需72h。
二、PCR及涂片、培养结果
47例患者中，涂片阳性12例；培养阳性17例;PCR检查阳性25例。其中，涂片与PCR均为阳性10例；涂片阴性而PCR阳性15例；PCR阴性而涂片阳性2例；涂片与PCR均为阴性20例。培养与PCR比较，两者均为阳性15例；培养阴性而PCR为阳性10例；PCR阴性而培养阳性2例；培养与PCR均为阴性20例。!2检验显示PCR与标本涂片相比有显著性差异(P=0.)，PCR检出率明显高于标本涂片；PCR与细菌培养相比有显著性差异(P=0.)，PCR检出率高于细菌培养。
通过计算可以得出PCR组中阳性率为53.19%，涂片组中阳性率为25.53%，培养组中阳性率为36.17%。
三、直接基因测序及微生物培养结果
研究组基因诊断方法检出19例，最终微生物学检查阳性19例(40.4%)。
对照组微生物培养阳性17例，最终微生物学阳性17例(36.2%)，见表1。PCR联合直接基因测序技术对比作为黄金标准的微生物培养，敏感性为91.67%，特异性为77.14%，Kappa值为0.(Kappa﹤0.4表明不能应用于临床；Kappa为0.4~0.8，表明可用于临床；Kappa﹥0.8表明能应用于临床而且可替代目前“金标准”)，阳性预测值为57.89%，阴性预测值为96.43%。
讨论
感染性眼内炎常发生于术后或外伤后，及时明确感染病原体，并及时给予针对性治疗，对眼内炎的预后至关重要。
对于怀疑或确诊眼内炎的患者，常用的临床检查方法是涂片检查、微生物培养、PCR等。涂片检查能快速得出结果，但检出阳性率低，不能查出敏感的抗生素，故临床指导意义相对小。微生物培养和药物敏感试验是目前诊断感染性眼内炎的“金标准”，对临床指导意义大。但是，其检出率不高，不能快速明确病原体种类和及时选取敏感性高的抗生素。所以，微生物培养和药物敏感试验已不能完全满足眼科临床的需要。
PCR联合直接基因测序技术利用PCR技术对感染菌株进行DNA指纹分型，其优点是快速、重复性好、分辨率高。本研究中，PCR联合基因诊断方法耗时低于涂片、培养等方法。此外，PCR反应敏感度高，适合眼科的微量标本，只要有微量病原体或遗传物质没有被破坏即可检出。这使PCR联合直接基因测序技术非常适合在眼科应用。这项技术能有效分辨细菌种属。本研究中，与目前作为“金标准”的微生物培养相比，细菌分类几乎全部相同，可以根据细菌分类选择抗生素的应用，已具备了对实际临床用药的指导作用。
PCR联合直接基因测序技术对于厌氧菌的检出具有优势。感染性眼内炎的厌氧菌培养阳性率一直很低。PCR联合直接基因测序检出技术可以通过扩增反应对靶物快速大量复制，所以对于厌氧菌即使死亡或存在量很少，也有可能被检出。
此项技术也有一定缺陷，其敏感性高，易造成假阳性，需严格进行无菌操作，对复合感染不能检出。PCR扩增选择扩增靶物是单一的，如果存在两种或两种以上病原体，检测时不同基因序列混合在一起并扩增，不能成为反映特异性的复制产物，不能反映出病原体的基因特点。PCR联合直接基因测序检出技术不能对已检出的细菌进行敏感药物判定，但是确定致病菌的种类后，可以根据致病菌的种类经验性选择敏感抗生素，比单纯应用广谱抗生素的治疗效果好。
综上所述，PCR联合直接基因测序技术可以缩短感染性眼内炎患者致病菌的诊断时间，便于及时应用有效抗生素，是一种快速﹑有效的临床检验感染性眼内炎方法。
专家介绍韩崧
医院眼外伤科副主任医师。
擅长眼底疾病，外伤，白内障，眼眶骨折等眼科疾病的诊治。
专家介绍庞秀琴
医院眼外伤科主任医师。
年毕业于首都医科大学医疗系，同年分配到医院眼科工作至今。～年间在日本埼玉医科大学医疗中心、著名眼外伤专家河井克仁教授指导下研修。并先后两次应邀赴日进行学术交流。担任全国眼外伤学组委员、眼科杂志编委、中华眼科杂志审稿员、北京市医疗事故鉴定委员会及劳动鉴定委员会委员、中央干部保健局会诊专家等。从事眼科工作29年来，擅长眼外伤专业，对复杂的眼外伤进行眼前后段组织的修复有较全面的技术及丰富的临床经验，是80年代末国内最早开展玻璃体手术者之一。对眶内异物、眼内巨大异物、微小异物等各种不同异物的定位方法、联合手术摘出方式及远期疗效进行了深入的研究，以第一作者于2年获北京市科学技术二等奖。对于增生性玻璃体视网膜病变及眼内炎的手术和药物治疗以及应用显微眼内窥镜下的手术治疗已取得初步的成果。在国家级杂志上发表论文26篇，其中核心期刊16篇，主编“同仁眼外伤手术治疗学”医学专著1部、参编8部。荣获北京市科学技术二等奖两项、三等奖一项、北京市卫生局科技进步奖两项、医院新技术奖两项。
专家介绍刘毅
医院眼外伤科主任医师。
年开始从事眼科临床学习和工作。年毕业于原大连医学院。年毕业于原上海医医院，获医学博士学位。
2年获ICO/IFOS临床奖学金资助，曾在德国Erlangen-Nürnberg大学眼科，波兰Lublin医院进修眼科手术。曾在美国TheNewEnglandCollegeofOptometry学习角膜接触镜。
来源：《北京医学》年第30卷第7期韩崧、庞秀琴、刘毅
责任编辑：秦爽
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