NLRP3炎性小体在眼部疾病中作用的研究
本文原载于《中华眼科杂志》年第5期
NLRP3（nucleotide-bindingoligomerizationdomain-likereceptorpyrindomaincontaining-3）炎性小体是细胞内一类多蛋白复合体，活化后能使半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（cysteine-asparticproteases-1，caspase-1）前体裂解为具有活性的caspase-1。caspase-1可促使IL-1β前体和IL-18前体加工为具有生物学活性的IL-1β和IL-18，随后释放到细胞外，参与炎性反应的进程[1]。近年来，NLRP3炎性小体是生物医学领域的研究热点，有关其在诸多眼病中作用机制的研究已取得一定进展，其中包括干眼[2,3,4]、角膜炎[5,6,7]等角结膜病以及糖尿病视网膜病变（diabeticretinopathy，DR）[8,9,10,11]、AMD[12,13,14,15]等眼底病变。本文针对NLRP3炎性小体在眼病中的作用进行总结和分析。
一、NLRP3炎性小体的结构及其在眼内的表达
NLRP3炎性小体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingcaspaserecruitmentdomain，ASC）和caspase-1前体组成。NLRP3是NOD（nucleotide-bindingoligomerizationdomain）样受体（NOD-likereceptor，NLR）家族中的一员，可以识别多种病原体和危险分子。NLRP3的结构包含3个部分：C端是富含亮氨酸的重复结构域（leucine-richrepeats，LRR），可感知微生物源或相关信号分子；中间是核酸结合寡聚结构域（nucleotide-bindingandoligomerizationdomain，NACHT），介导NLRP3自身寡聚化；N端是热蛋白结构域（pyrindomain，PYD），可以招募ASC。而ASC的胱天蛋白酶募集结构域（caspaserecruitmentdomain，CARD）可与caspase-1前体的CARD结构域发生相互作用[16,17]。NLRP3炎性小体活化后可诱导caspase-1前体自身活化，使其自发裂解为有活性的caspase-1，进而促进IL-1β和IL-18前体的加工和活化[1]。
根据眼部病变的不同，NLRP3炎性小体可在招募至病变部位的免疫细胞如中性粒细胞[18]，或在眼部的固有细胞，如结膜杯状细胞[19]、角膜和结膜上皮细胞[3]、RPE细胞和光感受器细胞[20,21,22]中表达。
二、NLRP3炎性小体的活化机制
NLRP3炎性小体在不同眼病中的活化机制不尽相同，但大多数情况下是通过双信号模式活化。第1个信号为炎性小体活化做准备，大多数细胞中的NLRP3和IL-1β前体并不持续表达或呈低水平表达，因此NLRP3炎性小体活化前需要有准备信号，以诱导相关蛋白的表达[23]。多数研究采用细菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）[21]、碳六烯酸氧化物的加合物蛋白[24]等促炎因子活化Toll样受体（Toll-likereceptor，TLR）及其下游的NF-κB等转录因子，以诱导IL-1β前体和NLRP3的表达上调到一定水平，以便进一步研究NLRP3炎性小体的功能。第2个信号是各种内源和外源性刺激物，促使NLRP3炎性小体的组装和活化。在眼病研究中，不同刺激物活化NLRP3炎性小体的机制包括3种：（1）细胞内活性氧自由基（reactiveoxygenspecies，ROS）：ROS的升高能促进NLRP3炎性小体活化[2,3,25]。研究结果表明，ROS能通过促使细胞中硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxininteractingprotein，TXNIP）与其抑制剂硫氧还蛋白分离，并与NLRP3作用而促使NLRP3炎性小体活化[10,26,27]。（2）溶酶体酶：溶酶体膜的破坏导致溶酶体酶释放至细胞质中，诱导依赖于caspase-1和组织蛋白酶B（cathepsinB）的NLRP3炎性小体活化[21,28,29]。（3）钾离子外流：细胞受到刺激后可诱发三磷酸腺苷释放，活化P2X7嘌呤受体，引起细胞内钾离子外流，进而活化NLRP3炎性小体[19,30,31]。尽管不同的刺激因素引起NLRP3炎性小体活化的方式不同，但不排除ROS产生、溶酶体酶释放、钾离子外流这3种NLRP3炎性小体活化机制之间的相互作用。
三、NLRP3炎性小体与眼部疾病
（一）NLRP3炎性小体和角结膜病
1．干眼：
干眼是由于泪液分泌或组成成分异常而引起的泪膜不稳定，从而导致眼表损伤和眼部不适的一类疾病，其病因包括眼局部的炎性反应、工作环境等多种因素。国内外诸多研究发现NLRP3炎性小体与干眼病的发生、发展相关，有可能作为干眼治疗的新型靶点。临床研究发现，NLRP3炎性小体和caspase-1、IL-1β及IL-18在干眼患者，尤其干燥综合征合并干眼患者的眼表组织中表达显著升高[4]。另有文献报道环境诱导的干眼患者眼表的ROS水平、NLRP3基因表达和IL-1β的释放均较对照组显著上调[3]。进一步的动物实验研究结果表明，环境引起的蒸发过强型干眼动物模型的ROS呈时间依赖性增加，与干眼临床指标的严重性呈正相关，进而引起炎性反应和角膜上皮损伤[2]。从细胞水平而言，NLRP3可作为受体识别ROS，上调NLRP3的水平可诱导NLRP3炎性小体活化，促进IL-1β分泌[3]。总之，患者、动物和细胞研究的结果均提示，NLRP3炎性小体在环境诱导的蒸发过强型干眼的发生和发展中具有一定作用，但与其他类型干眼的相关性有待进一步研究。
2．单纯疱疹性角膜炎（herpessimplexkeratitis，HSK）：
HSK是由单纯疱疹病毒（herpessimplexvirus，HSV）引起的角膜感染，可引发与炎性反应相关的角膜致盲性损伤，其中以HSV-1引起的HSK较为常见[5,32]。体外研究结果提示，NLRP3炎性小体和IFI16（gammainterferon-inducibleprotein16）炎性小体均可在HSV感染细胞后活化，并促进IL-1β产生[33]。动物实验结果表明，HSV-1感染Balb/c小鼠角膜引起HSK后，角膜中NLRP3、caspase-1和IL-1β的表达增加[6]。而在角膜感染HSV-1的早期，NLRP3基因敲除小鼠较野生型小鼠角膜中IL-1β等促炎因子的表达和中性粒细胞的浸润显著增加，并表现出更严重的损伤和新生血管生成，这提示NLRP3的缺乏会加重感染早期的眼部损伤，而NLRP3可能起到调节免疫炎性反应的作用[5]。再者，当向BALB/c小鼠前房注射缺乏与自噬相关蛋白Beclin结合结构域（Beclin-bindingdomain，BBD）的HSV-1后，BBD的缺乏使HSV对自噬的抑制作用减弱，因而使自噬活化增加，并且通过活化NLRP3炎性小体的方式诱导巨噬细胞及自然杀伤细胞介导的固有免疫应答，从而抑制病毒的复制[7]。最新研究结果提示，NLRP3炎性小体对HSK早期的炎性反应不是必需的，但是其他类型的炎性小体，如IFI16炎性小体，对此阶段的炎性反应是否起到重要的作用还有待进一步研究。
3．细菌性角膜、结膜感染：
角膜、结膜是眼表的重要组织，易感染细菌而诱发炎性反应。中性粒细胞是炎性反应初期招募至病变部位的最早和最主要的免疫细胞，是IL-1β产生的主要来源，而IL-1β有清除细菌的能力[18,34,35]。研究结果证实细菌性角膜、结膜炎的发生发展与NLRP3相关，虽然中性粒细胞可表达炎性小体的成分NLRP3和ASC[36]，但IL-1β的产生是否依赖于NLRP3炎性小体可能与感染细菌的种类有关。研究结果表明，金黄色葡萄球菌细胞壁的成分能增加大鼠结膜杯状细胞中IL-1β前体的表达，而其细菌毒素能活化NLRP3炎性小体，促进IL-1β分泌，但炎性小体的活化机制尚不明确，而且也不能确定IL-1β的分泌是否仅依赖于NLRP3炎性小体的活化[19]。此外，Karthikeyan等[34]从肺炎链球菌性角膜炎和绿脓杆菌性角膜炎的角膜溃疡处取材，检测到NLRP3、ASC和IL-1β表达均较正常角膜显著升高，提示NLRP3炎性小体参与疾病的病理过程。相关动物实验结果则表明，在急性肺炎链球菌性角膜炎的C57BL/6小鼠模型中，IL-1β的成熟依赖于NLRP3炎性小体的活化[18]；而在绿脓杆菌性角膜炎的C57BL/6小鼠模型中，中性粒细胞介导的IL-1β的分泌依赖于丝氨酸蛋白酶，与NLR家族4炎性小体无关[35]，但此研究中并未涉及中性粒细胞介导的IL-1β的分泌是否与NLRP3炎性小体相关。虽然目前的研究均集中针对炎性反应早期的中性粒细胞，但这并不排除在炎性反应后期，巨噬细胞等免疫细胞被招募至感染部位，通过NLRP3炎性小体活化而诱导固有免疫反应。
（二）葡萄膜炎
葡萄膜炎是发生于葡萄膜、视网膜血管和玻璃体的炎性反应，也被称为眼内炎性反应。研究结果表明IL-1β可能与葡萄膜炎的进展有关[37]；应用中和IL-1β的抗体治疗葡萄膜炎的安全性和有效性已得到初步证实[38]。细胞实验结果表明，对有眼内炎性反应表现的Behcet病患者的巨噬细胞进行培养，培养基中IL-1β水平显著升高，细胞中也可检测到NLRP3炎性小体的活化[39]。在内毒素诱导的葡萄膜炎动物模型（endotoxin-induceduveitis，EIU）中，NLRP3炎性小体活化，IL-1β产生增加[40]；而阻止炎性小体激活caspase-1，能减少IL-1β产生和玻璃体中炎症细胞浸润，从而减轻炎性反应[41]。但是，有研究得出相反的结果。Rosenzweig等[42]发现，在EIU模型中，虽然NLRP3炎性小体的成分在眼组织中持续表达，而且NLRP3和caspase-1基因敲除C57BL/6鼠的IL-1β产生会显著减少，但疾病的严重程度并未明显改变，提示NLRP3炎性小体对于EIU的进展无关键性作用。综上所述，关于NLRP3炎性小体在葡萄膜炎发病机制中作用的研究，现阶段以EIU模型为主，而NLRP3炎性小体在其他类型葡萄膜炎中的作用还有待研究。
（三）青光眼
青光眼是一类由高眼压或其他危险因素引起的不可逆性致盲性眼病，可导致视网膜神经节细胞（retinalganglioncell，RGC）死亡和视神经损伤。多项研究结果表明，胶质细胞的活化及继发的炎性反应在青光眼RGC死亡和视神经变性过程中起到重要作用，并与NLRP3炎性小体等多条信号通路的激活有关[43,44,45]。Yang等[43]发现在青光眼患者的视网膜中，NLRP3炎性小体的成分NLRP3、caspase-1的表达显著增加，提示NLRP3炎性小体在青光眼患者视网膜中活化。在青光眼大鼠模型的视网膜星形胶质细胞中，NLRP3炎性小体活化，并与肿瘤坏死因子α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）或TNF受体（tumornecrosisfactorreceptor，TNFR）系统、自噬等信号通路共同参与炎性反应[46]。
此外，视网膜缺血再灌注（ischemia-reperfusion，IR）损伤与急性青光眼密切相关，常导致RGC死亡、视网膜功能下降和视力损伤，而NLRP3炎性小体与视网膜IR损伤有一定相关性。Chi等[45]发现在视网膜IR模拟的急性青光眼小鼠模型中，视网膜Toll样受体4的表达增加，诱导caspase-8活化，引起NLRP3和NLRP1炎性小体活化，并促使IL-1β产生，进而促进RGC死亡和视网膜缺血性损伤，但是IL-1β的产生还与未知的信号通路有关。此研究小组进一步研究发现，在IR引起的小鼠急性青光眼模型中，Toll样受体4与内源性配体高迁移率族蛋白B1（high-mobilitygroupbox1，HMGB1）结合，而HMGB1经NF-κB通路促进NLRP3炎性小体活化和IL-1β产生，同时还促进依赖于caspase-8的未知炎性小体活化，最终导致视网膜缺血性损伤[47]。研究还发现，抑制Toll样受体4可短暂抑制NLRP3炎性小体活化，减少视网膜细胞凋亡，并挽救视网膜功能；而抑制Toll样受体4后24h，NLRP3的表达再次升高，提示NLRP3可能被未知的炎性小体或其他通路调节[48]。因此，在高眼压引起的急性青光眼眼底病变中，NLRP3炎性小体介导的炎性反应与RGC死亡和视网膜缺血性损伤密切相关，这为急性青光眼的治疗和干预提供了可能的靶点。
（四）DR
DR是糖尿病常见的微血管并发症，视网膜血管和神经细胞易受累。目前，相关研究大多是利用1型和2型糖尿病的动物模型进行DR的发病机制研究。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的糖尿病大鼠是经典的1型糖尿病模型。Devi等[9]发现STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜中Müller细胞活化，NLRP3炎性小体以及自噬、细胞凋亡等细胞防御机制被激活，共同参与细胞死亡和微血管病变的发展。其中NLRP3炎性小体的活化与TXNIP的表达上调相关，抑制TXNIP的表达可显著减少IL-1β的产生。体外实验结果也表明，高浓度糖刺激可诱导大鼠Müller细胞系rMC-1中TXNIP的表达上调，caspase-1活化，这提示炎性小体的激活[11]。另有实验结果表明，自抑制高浓度糖刺激的RPE细胞系ARPE-19中自噬体形成后，受损线粒体的ROS产生显著增加，NLRP3炎性小体活化，细胞死亡亦显著增加，提示自噬对DR的保护作用可能与抑制NLRP3炎性小体活化有关[8]。
另一方面，高脂饮食可引起大鼠胰岛素分泌量减退和糖耐量降低，因此高脂饮食加小剂量STZ注射能诱导出具有胰岛素抵抗特征的2型糖尿病动物模型。Mohamed等[48]发现单独应用高脂饮食可显著增加大鼠视网膜内皮细胞和胶质细胞中NLRP3和TXNIP的相互作用，使炎性小体活化；当合并高血压时，可诱导视网膜中无细胞毛细血管结构形成增加，视网膜中TXNIP表达上调，并引起视网膜微血管变性。体外实验结果也表明，在高脂条件下培养的人视网膜血管内皮细胞中，TXNIP可参与NLRP3炎性小体的活化，进而引起细胞死亡。
综上所述，NLRP3炎性小体和其他通路共同参与DR的免疫反应和炎性反应，导致视网膜的神经和微血管损伤。研究NLRP3炎性小体有助于深入揭示DR发病的分子机制。
四、结语和展望
在宿主防御和炎性反应疾病的过程中诱发固有免疫反应时，炎性小体活化是至关重要的一步，而NLRP3炎性小体是目前研究最广、最具特征的炎性小体，是细胞质内多分子聚合体，为caspase-1、IL-1β和IL-18的活化提供平台。健康状态下，NLRP3炎性小体持续性表达，起到监督、识别病原体和危险信号的作用；在急性炎性反应期，炎性小体活化后，可参与炎性反应，活化固有免疫反应；而当急性炎性反应转变为慢性炎性反应时，炎性小体能通过炎性反应坏死（pyroptosis）的程序化细胞死亡模式加重炎性反应[19]。
NLRP3炎性小体在不同的眼病中可能起到加重或缓解疾病的作用，这可能与疾病的不同阶段或亚型、活化炎性小体所在的细胞类型以及所诱导分泌的细胞因子有关。但是，现有的结论是建立在细胞或动物模型研究的基础上，实验条件不能完全模拟人体内的病理变化；而且部分眼病的模型较为单一，因此炎性小体的活化机制及其与疾病调节的其他信号通路之间的相互作用还有待深入研究，从而为将NLRP3炎性小体作为眼部疾病的新型治疗靶点提供更充分的理论依据。
参考文献
预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
